猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立与优化

更新时间:2023-05-28

【摘要】为了能够同时检测猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)和猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3),试验根据国内报道的PCV-2和PCV-3毒株全基因序列设计6对特异性引物(P3～P8),并构建标准质粒进行引物特异性试验,然后通过优化扩增条件建立检测PCV-2和PCV-3混合感染的双重PCR方法。最后用PCV-2和PCV-3的感染性克隆同时转染PK-15细胞,盲传5代后用建立的双重PCR方法检测细胞培养液中的病毒核酸。结果表明:构建的PCV-2和PCV-3标准质粒浓度分别为290 ng/μL和380 ng/μL,双重PCR方法的最佳引物组合为P3/P6和P4/P8,最佳DNA聚合酶浓度为0.02 U/μL。使用引物组合P3/P6时,扩增得到的目的片段大小分别为308 bp和608 bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为28个;使用引物组合P4/P8时,扩增得到的目的片段大小分别为291 bp和645 bp,最佳退火温度为60℃,最佳循环次数为26个。运用建立好的双重PCR方法评估感染细胞模型,能有效鉴别PCV-2和PCV-3的单一感染和混合感染。说明优化得到的双重PCR检测方法可用于PCV-2和PCV-3的同时检测。

【关键词】 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 双重PCR 引物 退火温度 循环次数

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